方案優勢

快速準確

采用標準

國家相關標準

方法/原理/步驟

　　實驗方法

　　(1)土霉素、四環素、金霉素、氯霉素標準儲備液的配制

　　分別稱取O.0100mg土霉素、四環素、金霉素、氯霉素標準品置于4個1Oml容量瓶中，分別加入甲醇溶解并定容至刻度，此溶液濃度分別為1.00mg/ml，置于冰箱冷藏室保存。

　　(2)混合標準中間液的配制

　　分別吸取土霉素、四環素標準儲備液各1.00ml，金霉素、氯霉素標準儲備液各2.00m1.置于100ml容量瓶中，用流動相A液定容至刻度，此溶液濃度分別為：土霉素(10μg/m1)、四環素(10μg/m1)、金霉素(20μg/m1)、氯霉素(20μg/m1)，置于冰箱冷藏室保存。

　　(3)標準使用液的配制

　　準確吸取混合標準中間液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml分別置于1Oml容量瓶中，用流動相A液定容至刻度，得到的標準系列為：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/m1(土霉素、四環素);0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/m1(金霉素、氯霉素)。

　　(4)流動相A液的配制

　　0.01mol/L磷酸二氫鈉+0.001mol/L EDTA，用30%硝酸調至pH=2.0，經0.45μm雙層水系濾膜過濾。

　　(5)流動相B液的配制

　　0.01mol/L磷酸二氫鈉，用30%硝酸調至pH=2.0，經0.45μm雙層水系濾膜過濾。

　　(6)樣品前處理

　　準確稱取5.00g攪碎的水產品于5Oml帶蓋的塑料離心管中，加入20%高氯酸溶液15ml，渦旋1min，將此離心管放入超聲波清洗器中提取20min后，用離心機離心10min，收集上清液于25ml容量瓶中，往殘渣中加入1Oml 2%高氯酸溶液，用玻棒攪動使樣品均勻分散于高氯酸溶液中，將此離心管放入超聲波清洗器中提取20min后，用離心機離心10min，收集上清液于上述25ml容量瓶中，合并兩次上清液，用2%高氯酸溶液定容，取該提取液1O ml經已調節的固相萃取小柱吸附，用10%甲醇水2ml沖洗固相萃取小柱，用50%甲醇水1ml洗脫后收集備用。

　　(7)樣品測定

　　吸取樣品溶液20μl進樣，進行HPLC分析，記錄四種抗生素的峰面積。根據4種抗生素的保留時間和紫外吸收光譜圖定性，峰面積定量。

儀器設備

　　儀器與試劑

　　LC7000型高效液相色譜儀，LC7060二極管陣列檢測器，LC7050自動進樣器;SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm色譜柱。固相萃取小柱為ZORBAX SPE C18Cart。12頭固相萃取真空富集裝置(Alltech Scientific Limited)。超聲波清洗器KS—500D，超速離心機LD4—2，攪肉機，渦旋混合器。甲醇(色譜純)，磷酸二氫鈉(分析純)，EDTA(分析純)，高氯酸溶液(優級純)、硝酸(優級純)。土霉素、四環素、金霉素、氯霉素標準品(SIGMA公司)。

　　高效液相色譜分析條件

　　色譜柱為SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm，流動相為0.O1mol/L磷酸二氫鈉+0.001 mol/L EDTA:甲醇=60:40(V/V，pH=2.0)，流速為0.8ml/min，檢測波長為268nm柱溫為25℃，進樣量為20μl。

結果與結論

　　結果

　　1、色譜分離條件的選擇

　　(1)檢測波長的選擇

　　土霉素、四環素、金霉素在268nm、355nm處各有1個吸收峰，氯霉素在278nm處有1個吸收峰，分別在波長268nm、278nm和355nm下用高效液相色譜儀以4種抗生素的混合標準進行測定，結果表明:在波長268nm下4種抗生素色譜峰分離較好且測定靈敏度明顯高于278nm、355nm處，實際樣品在此波長條件下的溶劑峰對4種抗生素的測定無影響，故選擇測定波長為268nm。

　　(2)流動相的選擇

　　流動相配比的選擇

　　為了有利于色譜峰的分離，選用0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液和甲醇的混合液為流動相。分別進行V磷酸二氫鈉：V甲醇=70：30、65：35、60：40、55：45的試驗。由所得色譜圖及測定數據可以看出，隨著流動相中甲醇含量的增加，4種抗生素測定的靈敏度升高，保留時間減少，但色譜峰分離變差。權衡分離度和保留時間，本方法選用V磷酸二氫鈉：V甲醇=60：40為流動相。實際樣品在此流動相條件下的雜質峰對4種抗生素的測定無干擾。

　　流動相的優化

　　流動相中0.001mol/L EDTA二鈉可以使分離效果更好。

　　流動相中加入EDTA二鈉，提高了方法的精密度。原因是四環素類抗生素分子中含有酚羥基和烯醇基，易與二價金屬結合，因而造成重現性差，流動相中加入適量EDTA二鈉可以改善這種現象。

　　2、樣品前處理條件的選擇

　　(1)樣品提取液的選擇

　　用高氯酸水溶液作為提取液是因為4種抗生素都能夠溶解于水，高氯酸可沉淀水產品中的蛋白質。用魚肝樣品分別做濃度為0.1%、2%和5%高氯酸溶液的抗生素提取試驗，隨著高氯酸濃度的增大，樣品中的蛋白質沉淀更加完全，有利于提取液的過濾，但高氯酸濃度過大不僅會對溶液中的抗生素起一定的破壞作用，影響測定的靈敏度，而且也會造成試劑的浪費，綜合考慮過濾的效果及測定的靈敏度，選取高氯酸濃度為2%。

　　(2)全自動固相萃取條件的選擇

　　反相固相萃取程序：調節-上樣-沖洗-洗脫

　　調節:在本研究中，先用2 ml甲醇沖洗固相萃取小柱，再用2ml水沖洗固相萃取小柱。

　　上樣:將樣品加到固相萃取小柱上。

　　沖洗:在本研究中，用10%甲醇水將干擾物沖洗下來。

　　洗脫:在本研究中，用50%甲醇水將4種抗生素洗脫下來，收集樣品用于分析。

　　固相萃取條件的選擇實際上是洗脫液的選擇:混標中每種抗生素的濃度為0.5μg/ml。

　　洗脫液準備：配制O%、10%、20%、30%……100%甲醇水

　　試驗步驟:用11支固相萃取柱經調節后，分別上樣10ml上述混標，分別用0%、10%、20%、30%……100%甲醇水各1ml洗脫，收集洗脫液，進行HPLC測定，以各種抗生素的濃度為縱坐標。甲醇水濃度為橫坐標作圖，得到固相萃取曲線，并計算最佳萃取條件下4種抗生素的固相萃取回收率。

　　試驗結果：隨著洗脫液中甲醇含量的升高，土霉素、四環素的分離度明顯下降，各色譜峰的峰寬增大;另一方面，隨著洗脫液中甲醇含量的升高，洗脫液中4種抗生素的濃度急劇上升，用10%甲醇水洗脫時，洗脫液中四種抗生素的濃度為0，至50%甲醇水時，四種抗生素的濃度已達最大5.0μg/ml，而這時土霉素、四環素仍能夠很好分離，因此，選定最佳洗脫液為50%甲醇水，在此固相萃取條件下的固相萃取回收率分別為:土霉素100.6%、四環素99.2%、金霉素100.8%，氯霉素98.8%。固相萃取能將四種抗生素的檢測靈敏度提高l0倍左右，魚肝不經固相萃取及經固相萃取的樣品都作HPLC測定，兩者的HPLC譜圖比較發現，經過SPE萃取柱純化并濃縮的樣品，雜質峰較少，土霉素峰清晰，并可看到四環素峰;而未經固相萃取的樣品土霉素峰很低，雜質峰多，檢測不到四環素。

　　3、方法的線性和最低檢出濃度

　　用土霉素、四環素濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/ml，金霉素、氯霉素濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/ml的混合標準溶液，在規定的色譜條件下，進樣20μl，進行測定，求4種抗生素的響應峰面積—濃度的線性回歸方程，其回歸方程及相關系數r分別為:

　　土霉素：Y=56.3215x-0.9004.r=0.9999;

　　四環素：Y=42.8345x-1.1484.r=0.99991

　　金霉素：Y=23.0097x-0.9630.r=0.9999;

　　氯霉素：Y=38.8332x+0.1655，r=0.9999。

　　表明在該濃度范圍內呈線性關系，符合定量要求。

　　以基線噪音的3倍計算方法的最低檢出濃度，土霉素(0.018 mg/kg)、四環素(0.025 mg/kg)、金霉素(0.043 mg/kg)、氯霉素(0.010mg/kg)。

　　4、方法的回收率和精密度

　　以空白魚肉樣品為本底，分別加入不同量的抗生素，測定方法的加標回收率及精密度(每個樣品平行測定6次)。

　　結論

　　通過高氯酸沉淀蛋白質、超聲波提取樣品、固相萃取的前處理方法，以及優化高效液相色譜條件下，成功地進行了水產品中土霉素、四環素、金霉素、氯霉素四種抗生素殘留同時進行固相萃取和高效液相色譜測定的方法研究，目前已檢測蝦、蟹、鯇魚、鯽魚共印份。實驗結果表明：該方法測定靈敏度高、穩定性好、簡便易行，四種被測組分色譜分離效果好。