方案優(yōu)勢(shì)

該方法準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，并能有效地控制醋氯芬酸腸溶膠囊的質(zhì)量。

采用標(biāo)準(zhǔn)

相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

方法/原理/步驟

　　試藥

　　醋氯芬酸腸溶膠囊(批號(hào)：100777-200401，含量：100%)、雙氯芬酸對(duì)照品、醋氯酚酸甲酯對(duì)照品、醋氯酚酸乙酯對(duì)照品、醋氯酚酸芐酯對(duì)照品、雙氯芬酸甲酯對(duì)照品、雙氯芬酸乙酯對(duì)照品、雙氯芬酸芐酯對(duì)照品、醋酸醋氯芬乙酸對(duì)照品、吲哚醋氯酚酸對(duì)照品、醋酸醋氯芬酸對(duì)照品(LGC GmbH Im Biotechnologiepark, D-14943 Lucknwalck, Germany)

　　甲醇、乙腈均為色譜純，水為三次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

　　溶液制備

　　對(duì)照品溶液：精密稱取各雜質(zhì)對(duì)照品各12.20mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得。

　　供試品溶液：精密稱取腸溶膠囊適量，用甲醇溶解并稀釋成每1mL約含1mg醋氯芬酸的溶液。搖勻，濾過，即得。

　　專屬性試驗(yàn)

　　取輔料，按處方配比，制成不含主藥醋氯芬酸的空白溶劑，超聲取上清液，作為供試品溶液，精密量取20μL注入液相色譜儀，色譜圖見圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輔料不干擾本品的測(cè)定。稱取醋氯芬酸腸溶膠囊適量(約40mg)5份，另取等量的空白輔料作為平行對(duì)照，分別置于10mL容量瓶中，經(jīng)光(4500lx，5天)、酸(0.09 mol/L鹽酸，5min)、堿(0.05mol/L氫氧化鈉，5min)、高溫(120℃，5h)、氧化(30%H2O2溶液，4h)5種破壞試驗(yàn)，其中醋氯芬酸腸溶膠囊經(jīng)強(qiáng)光、高溫、強(qiáng)氧化未產(chǎn)生新的雜質(zhì)，經(jīng)酸堿破壞雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)I三種已知雜質(zhì)含量變大，而空白輔料均未產(chǎn)生破壞雜質(zhì)，色譜圖見圖1，結(jié)果表明本色譜條件可使醋氯芬酸與其他降解產(chǎn)物達(dá)到有效地分離，且與相鄰雜質(zhì)峰的分離度良好，符合要求。

　　線性范圍

　　精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用甲醇稀釋制成系列濃度溶液。分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以各自峰面積A為縱坐標(biāo)、濃度c為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，并以信噪比(S/N)=3計(jì)算各溶劑的最低檢測(cè)限，結(jié)果可見，各物質(zhì)在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

　　精密度試驗(yàn)

　　精密量取對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得各溶劑峰面積的RSD分別為1.5%、1.4%、1.04%、0.23%、0.6%、0.8%、1.3%。

　　回收率試驗(yàn)

　　分別配制低(80%)、中(100%)、高(120%)3種不同濃度的對(duì)照品溶液，以對(duì)照品溶液作對(duì)照。精密稱取供試品適量，分別加入上述不同濃度的對(duì)照溶液適量，溶解制成0.1 g/ml的溶液，搖勻，共9份。在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，得平均回收率(n=3)：雜質(zhì)A 98.8%、雜質(zhì)B99.2%、雜質(zhì)C100.2%、、雜質(zhì)D99.6%、、雜質(zhì)E102.3%、雜質(zhì)F100.7%、雜質(zhì)G99.1%、雜質(zhì)H100.9%、雜質(zhì)I99.5%、醋氯芬酸100.7%、

　　穩(wěn)定性試驗(yàn)

　　配置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液，在上述色譜條件下分別于0h，2h，4h，6h，8h進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得各溶劑峰面積的RSD分別為1.1%、1.7%、0.9%、1.2%、0.8%、1.2%、1.5%。

　　醋氯芬酸腸溶膠囊有關(guān)物質(zhì)分析

　　取供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣分析，譜圖見圖2，采用外標(biāo)法，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液各雜質(zhì)峰面積進(jìn)行比較，從而測(cè)得樣品各雜質(zhì)含量見下表。

儀器設(shè)備

　　儀器

　　LCMS-2010EV高效液相色譜儀(日本島津公司)；LC-MS solution液相色譜工作站(日本島津公司)Thermo BDS HYPERSIL C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)。

　　色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

　　色譜柱: Thermo BDS HYPERSIL C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)；流動(dòng)相A為20mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(用12g/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH=7.00)；流動(dòng)相B為甲醇-乙腈(1:1)；檢測(cè)波長為275 nm;柱溫為40℃；流速為1.0ml/min；進(jìn)樣量20μL。梯度程序如下

　　表1 梯度洗脫程序

結(jié)果與討論

　　結(jié)果

　　表醋氯芬酸膠囊樣品測(cè)定結(jié)果

　　討論

　　檢測(cè)波長的選擇

　　本實(shí)驗(yàn)利用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)醋氯芬酸對(duì)照品、樣品及雜質(zhì)對(duì)照品在全波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)醋氯芬酸在275nm處有最大吸收，且在此波長處，其他雜質(zhì)也有較好地吸收，故選擇了275nm作為含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查的檢測(cè)波長。

　　流動(dòng)相A pH的選擇

　　本實(shí)驗(yàn)考察了不同pH的磷酸鹽緩沖液時(shí)的色譜效果，結(jié)果顯示當(dāng)pH太小時(shí)，醋氯芬酸與雜質(zhì)A重合，這可能是由于醋氯芬酸發(fā)生了水解；當(dāng)pH太大時(shí)，峰形變差，最終選擇pH=7.0時(shí)，主峰與各雜質(zhì)峰基本達(dá)到分離。

　　流動(dòng)相B的選擇

　　本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇，乙腈，甲醇-乙腈對(duì)分離效果的影響，結(jié)果顯示流動(dòng)相B單獨(dú)使用甲醇或乙腈時(shí)，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度太小，且主峰拖尾嚴(yán)重，選用三元混合體系更有利于調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，通過考察不同比例的甲醇-乙腈，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其比例為1∶1時(shí)，保留時(shí)間、峰形和分離效果好。梯度程序的選擇醋氯芬酸及其9個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)差別較大，采用等度洗脫模式只能檢測(cè)到9個(gè)色譜峰，雜質(zhì)B和D重疊，并且檢測(cè)時(shí)間要到90分鐘，因此采用提多洗脫模式，既可以實(shí)現(xiàn)10各組分的基線分離，并且對(duì)于破會(huì)后的新雜質(zhì)也不影響測(cè)定，分析時(shí)間縮短一倍。醋氯芬酸的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易降解，并且原料中的副產(chǎn)物較多，該方法非常適合與醋氯芬酸及其制劑中雜質(zhì)的檢查。