方案優(yōu)勢

用HPLC-ELSD法對復方甘草酸銨注射液中未衍生的甘氨酸、鹽酸半胱氨酸進行直接測定，結(jié)果較滿意。

采用標準

現(xiàn)行標準中采用容量法分別測定鹽酸半胱氨酸與甘氨酸含量，但在實際檢驗中，該方法操作繁瑣，干擾因素多，誤差較大。現(xiàn)在氨基酸的含量一般都采用柱前衍生化RP-HPLC法測定心引，由于柱前衍生化反應溶液量較少，試劑容易揮發(fā)，衍生化時間較長，致使試驗條件不易控制；同時衍生物是否具有足夠的穩(wěn)定性也需要考察，這些因素的限制使該法不利于直接、快速測定氨基酸。

方法/原理/步驟

　　測試過程：

　　色譜條件

　　C18—ODL色譜柱(4.6 mm×250mm，5μm)；流動相A(乙腈)-B(5.0 mmol/L七氟丁酸的0.7%三氟醋酸溶液)，流動相A與流動相B梯度洗脫(0-5 min，0：100；5-10 min，15：85；10-25 min，35：65)；ELSD漂移管溫度80℃(氮氣流量2.0 L·min-1，流速0.8 mL·min-1，柱溫35℃，進樣量10μL，理論塔板數(shù)按甘氨酸峰計不低于3000。

　　對照品溶液制備

　　分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的甘氨酸對照品97.15mg、鹽酸半胱氨酸對照品7.72mg，置10mL量瓶中，加0.01mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1mL置10mL量瓶中，加0.01mol/L。鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含甘氨酸0.9715g/L、鹽酸半胱氨酸0.0772g/L的對照品溶液。

　　供試品溶液制備

　　取本品1mL，移置20mL量瓶中，加0.01 mol/L。1鹽酸稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，備用。

　　陰性樣品溶液制備

　　取缺甘氨酸、鹽酸半胱氨酸的樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

　　空白試驗

　　為進一步確定方法的可行性，取陰性樣品溶液，依法測定，結(jié)果陰性樣品溶液色譜在與混合對照品峰相應的保留時間處無色譜峰，表明無干擾，色譜圖見圖1。

　　圖1復方甘草酸銨注射液HPLC色譜

　　線性關(guān)系考察

　　分別取上述對照品溶液5，10，15，20，25，30μL進樣，按上文的條件與方法進樣測定，以對照品的6個進樣量對數(shù)值x為橫坐標，以峰面積對數(shù)值y為縱坐標，進行線性回歸，甘氨酸回歸方程為y=1.351X+4.272(r=0.997 5)，線性范圍4.858～29.145μg；鹽酸半胱氨酸回歸方程為y=1.723X+8.911(r=0.995 2)，線性范圍0.386～2.316μg。

　　精密度試驗取對照品溶液，重復進樣5次，測定峰面積，甘氨酸RSD 1.97%，鹽酸半胱氨酸RSD 1.04%。

　　穩(wěn)定性試驗

　　取同一批供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，8，12 h測峰面積，甘氨酸峰面積12 h內(nèi)RSD 2.53%，鹽酸半胱氨酸峰面積12 h內(nèi)RsD 2.21%，說明甘氨酸與鹽酸半胱氨酸在0.01 m01.L“鹽酸中穩(wěn)定。

　　重復性試驗

　　取同一批樣品5份，制成供試品溶液，分別測定峰面積，利用標準曲線計算，甘氨酸與鹽酸半胱氨酸RSD分別為1.95%，2.07%。

　　回收率試驗

　　取已知含量的樣品(批號11041802，甘氨酸19.81 g·L～、鹽酸半胱氨酸1.466g·L。1)6份，每份0.5 mL，分別移置20 mL量瓶中，每份各精密加入對照品溶液1 mL(濃度為甘氨酸9.826 g·L～，鹽酸半胱氨酸0.747 g·L)，制成供試品溶液，分別測定。計算回收率，結(jié)果甘氨酸與鹽酸半胱氨酸平均回收率分別為97.43%，96.99%；RSD分別為1.61%，1.89%。見表1～2。

　　表1 氨酸加樣回收率試驗

　　表2 鹽酸半胱氨酸加樣回收率試驗

　　樣品含量測定取復方甘草酸銨注射液3批(11041802，11041803，11041804)，制成供試品溶液，分別測定。計算含量，結(jié)果3個批號的樣品含甘氨酸分別為19.81，19.49，19.58 g/L，含鹽酸半胱氨酸分別為1.466，1.471，1.449 g/L。

儀器設(shè)備

　　儀器與試藥

　　蘭博series 4060高效液相色譜儀

　　另外還有蘭博蒸發(fā)光散射檢測器(Ezchrom色譜管理軟件，美國lanbo公司)，電子天平，真空恒溫干燥箱，自動雙重純水蒸餾器。甘氨酸對照品、鹽酸半胱氨酸對照品；三氟乙酸七氟丁酸，色譜純乙腈，重蒸餾水，其余試劑為分析純。復方甘草酸銨注射液、缺甘氨酸、鹽酸半胱氨酸樣品。

討論:

　　方甘草酸銨注射液質(zhì)量標準H1規(guī)定用氯化溴滴定法測定鹽酸半胱氨酸含量，試驗要求加入1mol/L的鹽酸2 mL，靜置后生成白色沉淀，此凝乳狀沉淀使溶液黏稠，導致下一步過濾困難。亞硫酸鈉若去除不徹底，也會干擾檢驗結(jié)果，實踐中發(fā)現(xiàn)用該法含量測定結(jié)果偏高。

　　大部分氨基酸分子中無共軛結(jié)構(gòu)，無紫外吸收或較弱，所以不能直接用紫外檢測器檢測，只能通過適當衍生化后產(chǎn)生有紫外吸收的衍生物，方可用紫外檢測器或熒光檢測器檢測哺。現(xiàn)在常用的氨基酸柱前衍生法根據(jù)衍生化試劑不同有PITC法、AQC法、OPA.FMOc法和DNFB等法。這些方法本身要求反應選擇性強、定量進行，衍生物有足夠的穩(wěn)定性，但筆者通過試驗發(fā)現(xiàn)的OPA-半胱氨酸和DNFB-半胱氨酸衍生物均不穩(wěn)定，使用這兩種方法測半胱氨酸含量時誤差較大。采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測則可省去衍生化這一步驟，試驗時間大大縮短。

　　ELSD檢測器作為一種準通用型檢測器，僅對不揮發(fā)被分析物產(chǎn)生信號，其信號響應值僅取決于被分析物質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量，而不需考慮有無紫外吸收的問題，該檢測方法對流動相的變化不敏感，即使在梯度洗脫時基線也很平穩(wěn)。通過調(diào)節(jié)ELsD檢測器的漂移管溫度與載氣流速，可以使基線噪音最小，響應值相對最高，從而獲得很好的色譜圖。本研究中考察了漂移管溫度70，80，90℃，氣體流速1.8，2.0，2.2 L/min。1條件下的色譜情況，結(jié)果選定漂移管溫度80℃，氣體流速2.0 L/min。為試驗條件，該條件下基線平穩(wěn)，噪音小，被測成分均有適宜的響應值。

　　氨基酸在水溶液中為強電解質(zhì)，在極性溶劑中溶解度較大，在極性較弱的c18柱上保留時間非常短。七氟丁酸可與氨基酸分子形成離子對，抑制了氨基酸的解離，適當延長了保留時間，改善了峰型。本研究采用乙腈5.0 mmol/L的七氟丁酸-0.7%三氟乙酸系統(tǒng)，甘氨酸和半胱氨酸分離完全，色譜峰型對稱性好、峰形尖銳，保留時間適當。試驗全過程操作簡便，結(jié)果準確、可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。