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微平科技微平臺(tái)助力科研 www.weipingtest.cn/wpt 自主開(kāi)發(fā)單糖檢測(cè)方法 多糖中單糖組成的測(cè)定（PMP衍生法，適用還原性單糖） 一.? 試劑配制 (1) 2mol/L 三氟乙酸(TFA)水溶液： (2) 0.3 mol/L NaOH (3) 0.3 mol/L HCl (4) 0.5 mol/L PMP甲醇溶液:稱取0.4355g PMP用甲醇溶解,定容至5 mL (5) 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)液: 各單糖質(zhì)量濃度均為0.4mg/mL左右，水溶。使用時(shí)將之與0.6 mol/L NaOH 1:1混合再進(jìn)行衍生。 二.? 多糖水解 量取5mL樣品于10 mL的鉗口瓶中 , 加入1mL的TFA （TFA濃度約為2mol/L ）, 充 N2封管 , 110 ℃烘箱中水解6H; 冷卻后定容至10mL，取2mL加入一定量甲醇后,70℃水浴下用N2吹干,如此重復(fù)加甲醇并用N2吹干2次,以去除TFA; 加入1mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解殘?jiān)瑸槎嗵撬庖骸? 三.? 單糖衍生化 分別取 400μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液或多糖水解液于 5 mL的具塞試管中 , 加 400μL PMP甲醇溶液 , 漩渦混勻; 于70℃水浴中反應(yīng)2H; 取出放置冷卻至室溫;加400μL 0.3 mol/L的HCl中和（pH 6~7）;加水200μL , 再加等體積的氯仿，渦旋混勻振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取 2次。將水相用 0.45μm微孔膜(水系)過(guò)濾后供 HPLC進(jìn)樣分析。 四.? HPLC檢測(cè)條件 儀器型號(hào)：agilent1100,配DAD檢測(cè)器 色譜條件： 色譜柱C18柱，250mm*4.6mm，粒度5μm;流動(dòng)相A：100mM 磷酸鈉緩沖液（pH=6.5)；流動(dòng)相B:乙腈;檢測(cè)波長(zhǎng):250nm;柱溫30℃;流速1ml/min;進(jìn)樣量5ul; 梯度洗脫 T/min A% B% 0 85 15 10 83 17 30 80 20 35 60 40 36 85 15 40 85 15