檢測(cè)認(rèn)證人脈交流通訊錄
- 羊抗貓IgG血清
標(biāo)本的采集及保存
1.血清:全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
標(biāo)本的稀釋原則:
首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量,確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中,應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。最后計(jì)算濃度時(shí),稀釋了“N”倍,標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則:2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,其濃度為300 pg/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋300 pg/ml,150 pg/ml,75 pg/ml,37.5 pg/ml,18.5 pg/ml,9 pg/ml,4.5 pg/ml,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制150 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml(不要少于0.5ml)300 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則:
臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(每孔100μl),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則:
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(每孔100μl),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
羊抗貓IgG血清
試劑及配制
1、緩沖生理鹽水:
( 1) 貯存液: Na2HPO4.12H2O 2.85g
KH2PO4 0.27g
NaCl 17.00g
蒸餾水定容至 100ml
4℃保存?zhèn)溆?
( 2)應(yīng)用液: 5ml 貯存液加 95ml 蒸餾水,再加 10%硫酸鎂 0.1ml, 當(dāng)日配制, 12 小時(shí)內(nèi)使用。
2、2%綿羊紅細(xì)胞:無菌采取綿羊血液,于等量 Alsever 液中可保存 3 周。用前以緩沖液洗 3次,并配成 2%細(xì)胞懸液。必要時(shí)可用吸光光度法或細(xì)胞計(jì)數(shù)法使懸液細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化。
3、溶血素:將綿羊紅細(xì)胞溶血素(效價(jià) 1:4000),用應(yīng)用液做 1:2000 倍稀釋(即 1ml 溶血素加 1999ml 應(yīng)用液)。
4、待測(cè)血清:新鮮血液室溫放置 30min,再 4℃放置 60min,使血塊收縮, 4℃離心( 3000r/min)10min,取上清, -20℃保存。
羊抗貓IgG血清
常用標(biāo)簽包括有Flag、myc、HA、His、GST、GFP、MBP等。
Flag標(biāo)簽系統(tǒng)利用一個(gè)短的親水性八氨基酸肽(DYKDDDDK)融合到目標(biāo)蛋白;其純化條件是非變性的,因此可以純化所有有活性的融合蛋白。
His標(biāo)簽是由6個(gè)組氨酸(His-His-His-His-His-His)組成的短肽,專門設(shè)計(jì)用于重組蛋白的吸附純化。由于分子量小,且較容易分離和純化,是目前使用最廣泛的一種。
GST標(biāo)簽體系具有蛋白表達(dá)率高,表達(dá)產(chǎn)物純化方便,利于GST抗體制備的特點(diǎn)。GST融合蛋白在水溶液中可溶,可從細(xì)菌裂解液中提取,在不變性的條件下通過親和層析得到。
GFP或其突變體EGFP等廣泛用于基因表達(dá)效率的檢測(cè),以及和目的蛋白融合表達(dá)用于檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)和分別。GFP抗體不經(jīng)可以檢測(cè)GFP或其適當(dāng)?shù)耐蛔凅w,也可以檢測(cè)和GFP或其適當(dāng)?shù)耐蛔凅w融合表達(dá)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位,以及純化、定性或定量檢測(cè)GFP融合表達(dá)蛋白等。
Myc標(biāo)簽(序列為:EQKLISEEDL)已成功應(yīng)用于WB雜交技術(shù)、免疫沉淀IP和流式細(xì)胞術(shù)中。因此可用于檢測(cè)重組蛋白在細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳細(xì)胞中的表達(dá)情況。Myc重組蛋白質(zhì)可通過偶聯(lián)Myc標(biāo)簽抗體到活化的瓊脂糖上而進(jìn)行親和純化。但Myc重組蛋白的低pH洗脫條件往往會(huì)降低蛋白質(zhì)的活力,因此Myc標(biāo)簽系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)但很少用于純化。
HA標(biāo)簽系統(tǒng)利用一個(gè)HA(influenza hemagglutintin epitope:YPYDVPDYA)短肽融合到目標(biāo)蛋白。HA標(biāo)簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端,該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞類型,相應(yīng)的HA標(biāo)簽抗體也被廣泛運(yùn)用。
MBP標(biāo)簽蛋白大小為40kDa,由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá),MBP可以融合在蛋白的N端或C端。可用MBP抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)MBP標(biāo)簽標(biāo)記的重組蛋白。
其余標(biāo)簽抗體還有V5、GFP、RFP、β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、ERK1、AU1、Avi、B、CBP、DDDDK、E、E2、Glu-Glu、HAT、HPC4、HSV、KT3、KLH、MAT、Protein A、S、S1、SNAP、SRT、NWSHPQFEK、SUMO、T7、Tag-100、TAP、Trx、Ty1、TF、Universal、VSV-G等,但應(yīng)用相對(duì)較少。
上海篤瑪生物科技有限公司
楊燕燕
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