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SYTO 9培養(yǎng)條件和細(xì)菌懸液的制備

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　　SYTO 9培養(yǎng)條件和細(xì)菌懸液的制備　　SYTO 9/PI 活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒　　一、培養(yǎng)條件和細(xì)菌懸液的制備：　　【注意】：用本試劑盒進(jìn)行細(xì)菌染色，務(wù)必要小心去除培養(yǎng)基殘留，因?yàn)椋怂岷推渌囵B(yǎng)基成分可能以不可預(yù)料的方式與SYTO 9和PI結(jié)合，導(dǎo)致染色結(jié)果發(fā)生不可接受的變動(dòng)。簡(jiǎn)單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內(nèi)含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。　　1.1 用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌或Staphylococcus aureus（30ml）使其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。　　1.2 于10000×g離心10-15min，濃縮25ml細(xì)菌培養(yǎng)物。　　1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液來(lái)重懸沉淀。　　1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液的30-40ml離心管（設(shè)置為活細(xì)菌組），用含20ml 70%異丙醇（也可以用其他方法比如高熱處理殺死細(xì)菌）的30-40ml離心管（設(shè)置為死細(xì)菌組）。　　1.5 兩管樣品（分別為活細(xì)菌組和死細(xì)菌組）于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。　　1.6 兩管樣品（分別為活細(xì)菌組和死細(xì)菌組）于10000×g離心10-15min。　　1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。　　1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當(dāng)緩沖液重懸兩管樣品。　　1.9 分別取3ml菌液測(cè)定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）。　　1.10 對(duì)于大腸桿菌或Staphylococcus aureus的建議染色濃度，根據(jù)你的儀器類型（熒光顯微鏡、熒光光度經(jīng)、熒光酶標(biāo)儀）或流式細(xì)胞儀來(lái)參考相應(yīng)部分的染色條件。　　二、染色條件的優(yōu)化：　　試劑盒內(nèi)的兩種染料都經(jīng)過(guò)平衡優(yōu)化，按照1：1的比例進(jìn)行混合用于絕大多數(shù)的樣本都能得到良好的區(qū)分活/死細(xì)菌。偶然情況下，兩種染料的混合比例需根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。比如：在待檢樣本中，綠色熒光太突出，建議要么降低SYTO 9濃度，要么提高PI濃度。　　為了全面優(yōu)化染色條件，建議測(cè)試梯度濃度的SYTO 9，每一種濃度與梯度濃度的PI進(jìn)行組合染色。建議按照1ml細(xì)菌懸液加入3?l不同混合比率的染料預(yù)混液。　　[注]：SYTO 9 +PI 對(duì)細(xì)菌的染色請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)建議的15min來(lái)操作，不要超過(guò)30min。 SYTO 9有很好的細(xì)菌滲透性，我們給的實(shí)驗(yàn)條件都是優(yōu)化過(guò)。 SYTO 9只有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色，可能會(huì)延長(zhǎng)染色時(shí)間到120min。　　由于染的是活菌+死菌的比例，請(qǐng)染色后盡快觀察，不要超過(guò)1h。另，染色后基本是不用清洗的，除非覺(jué)得背景熒光很高，就是非細(xì)菌的菌體部分都能看到熒光，才有必要簡(jiǎn)單清洗一次。　　http://www.shujibio.com/Products-38611237.html 　　https://www.chem17.com/st326659/product_38611237.html

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